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“Annual Poster Day”
El pasado 21 de marzo se llevó a cabo el “Annual Poster Day”, donde todos los participantes de BioMinds tuvimos la oportunidad de presentar el trabajo que llevamos realizando a lo largo de este proceso. Como parte de esto, nos tocó evaluar a tres participantes.
Estudiante: Zuleika Corales Tirado
“Functional genomic and culture independent approaches to search for protease activity in Forest soils in Puerto Rico”
El trabajo de investigación de Zuleika tiene como objetivo, encontrar la actividad de las proteasas en diferentes suelos del Bosque Seco de Guánica, del Yunque, entre otros. Según lo que pude hablar con ella, me explicó que las proteasas son de las enzimas más utilizadas en las industrias, razón por la cual es de gran importancia el encontrar proteasas nuevas que puedan ser utilizadas y que demuestren actividad. En este caso, se utilizaron pruebas como crecimiento en leche por medio del cual comprobaron la actividad que tenía la caseína; además, la realización de PCR fue necesaria a modo de confirmación, o sea que si la actividad de la proteasa se debe al fragmento que ha sido clonado. Los resultados de este trabajo podrían ser de gran importancia, al encontrar nuevas proteasas. Me llamó mucho la atención el entusiasmo que demostró la estudiante al presentar su trabajo.
Estudiante: Juan Santiago Torres
“Lysozyme Crystallization with Neutral Hydrogels Providing Conditions for Counter-Diffusion”
Este trabajo fue uno de los que más me llamó la atención, y de lo cual debo decir que no tenía mucho conocimiento. La investigación de Juan consistía en una modificación de lo que se conoce como la técnica “Counter-Diffusion”, por medio de hidrogeles, en vez de utilizar otro tipo de geles más conocidas como por ejemplo la gel de agarosa. Para esto, se implementaron técnicas de cristalización de proteínas. Hasta el momento, los resultados obtenidos en esta investigación habían sido satisfactorios, y me impresionó el conocimiento del estudiante por este tema y su trabajo.
Estudiante: Aslin M. Rodriguez-Nassif
“Methodology to assess the inhibition of α-Amylase by Tapeinochilus ananassae extracts”
El trabajo de Aslin se basa en la utilización de la planta Tapeinochilus ananassae para pacientes diabéticos, y los efectos que puede tener esto. Su investigación consta del análisis de que la obesidad es un factor importante en la diabetes. Con el propósito de ayudar en este problema, se ha sugerido que la inhibición de α-amilasa podría reducir los niveles de azúcar en la sangre. Para esto, se examinó la inhibición de la enzima en la planta, por medio de extractos acuosos y metanólicos. En adición, se realizaron extractos con el flavonoide Quercetin y acarbosa, los cuales sirvieron como controles en la investigación. En base a esto, se midieron las concentraciones de estos componentes, para determinar así su eficacia en este estudio.
Nuevos progresos en el proyecto de investigación…
En lo que va de semestre, hemos estado trabajando fuertemente para cumplir a cabalidad las metas propuestas para este semestre. Hasta el momento, hemos estado purificando cepas, congelándolas una vez estas se encuentran puras y haciendo extracción de DNA. Para la próxima semana vamos a estar haciendo PCR con el propósito de amplificar el 16S RNA y luego hacer electroforesis de gel.
Cabe destacar, que hemos tenido algunas dificultades en estos días, debido a que se nos acabaron algunos materiales, como por ejemplo los platos Petri, y hasta que no llegue la orden que enviamos a comprar, no podemos continuar con la purificación de cepas, ni pasando las cepas a platos nuevos para su crecimiento. Debido a esto hemos decidido continuar con las extracciones de las cepas que tenemos congeladas, y realizar PCR. Estamos alternando algunos pasos en nuestra investigación, con el propósito de continuar trabajando efectivamente, y no tener que parar debido a la falta de ciertos materiales.
En cuanto al progreso de la investigación en una escala del 1-5, con relación a las metas establecidas en el mes de enero, puedo clasificarla como un 2. Entiéndase que llevamos algo de progreso, logrando al menos un 10% de los objetivos propuestos. A medida que continúe el semestre esperamos poder cumplir con todos los objetivos propuestos, o por lo menos con la mayoría de ellos.
Abstract de mi proyecto de investigación:
Extremophilic Diversity in Mangrove’s Rhizosphere; a Source of Putative
Novel Microorganisms with Biotechnological Potential
Mangroves are ecosystems of great importance for the natural maintenance of the coastal lands by complex interactions. The presence of halophilic bacteria had been documented on the leaves of these plants, but little is known about the microbial diversity present on the black mangrove rhizosphere. This is the reason why this research is oriented towards the determination of the microbial diversity present at these mangroves. An analysis of the diversity of halophilic or halotolerant microorganisms present in the soil of these black mangroves rhizosphere found in two different localities in the south area of Puerto Rico, the Salinas of Cabo Rojo and the Boquerón National Forest was carried out using culture-dependent and culture-independent techniques. Soil samples from six different plants of each locality and at three different depths (0cm, 10cm and 20cm) were taken and processed. As a culture-dependent, Seghal Gibbon’s (SG) media was used and subsequently techniques of purification in four quadrants and micro dilutions were applied. By using the culture-dependent technique, a representative sample of the diversity present in the soil was not recovered, so a DNA total extraction and PCR of 16sRNA were used to determine the presence of bacteria. Techniques like Terminal Restriction Fragment Polymorphism (TRFLP), was used to determine the diversity of the soil; and environmental gene libraries, which are used to obtain sequences of possible microorganisms that live in those places and are not cultivable, is going to be applied. This project hypothesizes whether there are halophilic/halotolerant microorganisms present in the black mangroves and if so, does this microbial diversity vary according to the depth and/or place. Thus far, it has been found that the black mangroves in the Salinas and in Boquerón contained presence of halophilic and halotolerant microorganisms. These characteristics are determined by physiological characterizations. Also, from the 16sRNA samples from two different plants at 0cm and 20cm from each location were amplified successfully. From the PCR of the TRFLP, without digestion, amplification of all the Boquerón samples was obtained. The results obtained from this research will provide information about the physiology and chemistry of the microbial populations interacting with the plant and provide novel organisms with biotechnological potential as well.
Nuevo semestre, nuevas metas y un mismo trabajo…
Para este semestre se busca continuar con el trabajo del semestre anterior; ya que continuaremos purificando y haciendo extracción de DNA de los microorganismos halofílicos/halotolerantes obtenidos en los muestreos anteriores. En adición, para el método dependiente de cultivo se va a realizar Box PCR y Secuenciación de DNA. Con la técnica del Box PCR se pretende la amplificación de todo el genoma del organismo, no solo de la región 16S como se ha estado haciendo anteriormente con el PCR. En la parte independiente de cultivo, vamos a continuar haciendo TRFLP con el propósito de determinar la diversidad del suelo; así como también vamos a realizar bibliotecas de genes para obtener las secuencias de posibles microorganismos que puedan habitar en esos ambientes pero que no son cultivables. El propósito de realizar estas técnicas, es poder identificar y caracterizar los microorganismos halofílicos/halotolerantes que se encuentran presentes en la rizosfera del mangle en Boquerón y las Salinas en Cabo Rojo.
Para finales de este semestre, se espera haber logrado obtener resultados positivos en el Box PCR, poder aislar los clones una vez realizada la biblioteca de genes, para entonces enviarlos a secuenciar. Además, este mes se va a realizar otro muestreo tanto en el bosque de Boquerón, como en las Salinas en Cabo Rojo; una vez realizado este muestreo hay que realizar todo el proceso que hemos hecho hasta el momento, pero ahora con nuevas muestras de suelo.
El objetivo más importante para mí, es poder tener éxito en la identificación y caracterización de los microorganismos que se han aislado hasta el momento en nuestros lugares de muestreo, y poder así conocer que organismos son los allí habitan, y conocer un poco más acerca de ellos y de su función. Esto, debido a que una de las metas de este proyecto es que los resultados que de aquí se obtengan sirvan para proveer información acerca de la fisiología y química de las poblaciones microbianas que interactúan con el mangle y que proveen nuevos organismos con algún potencial biotecnológico.
Resultados obtenidos hasta el momento y la experiencia de participar en ABRCMS
Este semestre fue uno de arduo trabajo, pero al final vimos los frutos de tanto esfuerzo. En cuanto a los resultados obtenidos, estos se van a dividir en dependientes e independientes de cultivo. Para la parte dependiente de cultivo, se realizó un conteo total de las colonias encontradas en las Salinas y en Boquerón, utilizando medio Seghal Gibbons al 10% y 15% de NaCl. En el caso de las Salinas, se encontró un número mayor de colonias a 10% de NaCl, lo cual pudo haberse debido a que la salinidad es un factor determinante para el crecimiento de las bacterias. Por otra parte, para el conteo realizado en el Bosque de Boquerón, se encontró un menor número de colonias que en las Salinas. Además, había menos colonias a 10% que a 15% de NaCl. También tuvimos la oportunidad de tomarle fotos a varias de las colonias, utilizando el Microscopio Electrónico de Rastreo. En estas fotos pudimos confirmar que nuestros microorganismos son bacilos; lo que sí capto nuestra atención, es que pudimos observar la diferencia entre los bacilos a 10% y a 15% de NaCl. A 15% estos bacilos se ven más alargados y más finitos; mientras que a 10% NaCl, los bacilos se observan más cortos y más anchos.
En cuanto a la parte independiente de cultivo, se realizaron varios PCR de Boquerón y Salinas. Para las muestras de Boquerón, se realizó un PCR de extracción total de DNA de las plantas D y K, a 0cm y 20cm; en este se observaron bandas en todas las plantas, pero en la planta K a 20cm no hubo amplificación. En cuanto a Salinas, se hizo un PCR de DNA total metagenómico de las plantas 13, 14, 15, 16, 17 y 18 a 0cm; donde se observaron bandas que indicaban la presencia de microorganismos, excepto en la planta 18, donde no se observó amplificación. En el PCR del 16S rDNA para las muestras 8 y 16 a 0cm de profundidad, se observó amplificación de la planta 16. Algunos de estos PCR están por repetirse, para determinar el porqué de las muestras que no amplificaron. Por último, se realizó un PCR de Arqueas a 0cm de profundidad, combinando muestras de Salinas y Boquerón; de este pudimos determinar que hasta el momento se ha encontrado la presencia de Arqueas en algunas muestras en Boquerón.
De acuerdo a los resultados obtenidos hasta este momento, puede concluirse que sí hay presencia de microorganismos halofílicos/halotolerantes en las Salinas de Cabo Rojo y en el Bosque Nacional de Boquerón (los cuales son los dos lugares de muestreo en la investigación), asociados al suelo del mangle negro. Además, la diversidad microbiana de estos microorganismos halofílicos/halotolerantes, varía dependiendo del lugar, la composición del suelo, y la salinidad a la que se cultivaron estas muestras, tanto 10% como 15% de NaCl.
En cuanto a las metas futuras para el próximo semestre podemos destacar varias cosas tanto para la parte dependiente de cultivo, como para la parte independiente de cultivo. Como dependiente de cultivo, se realizará Box PCR y luego secuenciación de DNA; por otra parte, para la parte independiente de cultivo se pretende continuar con el TRFLP, realizar biblioteca de genes, y secuenciación de DNA.
Experiencia en ABRCMS
Del 5 – 9 de noviembre de 2008, tuve la oportunidad de asistir y presentar mi poster de investigación en la Conferencia ABRCMS (Annual Biomedical Research Conference for Minority Students), celebrada en Orlando, Florida. Esta fue una gran experiencia, debido a que era la primera vez que estaba presentando un poster. En cuanto a la conferencia, puedo decir que fue una gran oportunidad, además de que tuve la oportunidad de escuhar a grandes profesionales de la ciencia hablando acerca de diversos tópicos. Dos conferencias que me llamaron mucho la atención, fueron la del Dr. David Page, titulada “Choosing Sex: How Germ Cells Take the Road Less Traveled”; y la de la Dra. Bonnie Bassler, “How Bacteria Talk to Each Other.” Por otra parte, participamos de conferencias relacionadas a cómo aplicar para escuela graduada, cómo sobrevivir los primeros 18 meses de doctorado (la cual fue muy interesante y realista), entre otras. En adición, ABRCMS fue mi oportunidad para tomar mi decisión final acerca de las escuelas graduadas a las que voy a solicitar para realizar mi PhD en Microbiología Clínica. Me ayudó a conocer un poco más acerca de diferentes escuelas, a conocer personas de contacto en esas escuelas, así como también de conocer nuevas escuelas y nuevos programas los cuales no conocía y que me interesaron. Agradezco al programa BioMinds por la oportunidad brindada, y por permitir realizar este viaje de enriquecimiento profesional.
Nuevos avances y progresos en la investigación
Durante este pasado mes, el trabajo en el laboratorio ha sido más intenso debido a la aceptación de nuestro “abstract” para participar en ABRCMS (Annual Biomedical Research Conference for Minorities Students), a celebrarse en Orlando, Florida la próxima semana (Noviembre 5-9). Es por esto que tuvimos que trabajar más arduamente para obtener unos resultados más concretos y completos para poder presentar en la Conferencia., y que esto sea todo un éxito, asi como una experiencia gratificante. En cuanto a los resultados obtenidos hasta el momento, hay que destacar que ya hemos contestado parte de nuestra hipótesis. Se ha encontrado la presencia de microorganismos halofílicos/halotolerantes en suelos asociados al mangle negro. Además, la diversidad de microbiana de estos organismos halofilicos/halotolerantes varía dependiendo el lugar de muestreo, la composición del suelo, la salinidad (10% y 15% NaCl) y la profundidad a la que se tomaron las muestras, ya sea 0cm, 10cm, y 20cm. Estos resultados han sido determinados, mediante la observación de crecimiento en plato, y además basándonos en el PCR 16s RNA y la extracción de DNA total a las muestras.
El progreso de esta investigación, basado en las metas propuestas a principios de este semestre, puede clasificarse entre un 2 y un 3. Esto se debe a que el proceso de purificación de las cepas, nos tomó más tiempo que el esperado; ya que una vez teníamos las cepas bastante puras, éstas se contaminaron con la presencia de algún organismo extraño dentro de la incubadora. Debido a esto tuvimos que volver a purificar las cepas, pero ya en este momento puede decirse que el 50% de estas están puras. En cuanto al análisis de diversidad de comunidades bacterianas, por medio de la realización de TRFLP, basado en los dos diferentes lugares de muestreo, a las diferentes profundidades, ya se llevó a cabo. Al realizar el TRFLP, solamente obtuvimos resultados satisfactorios en las muestras de Boquerón; todavía no hemos obtenido la concentración suficiente de DNA bacteriano, para poder resultados en el TRFLP realizado a las muestras de las Salinas.
Esperamos que antes de finalizar este semestre, pueda haberse logrado al menos el 80% de las metas propuestas; incluyéndose obtener resultados contundentes en los TRFLP de las muestras; y una vez obtenido esto, tal vez para principios del próximo semestre puedan realizarse las genotecas ambientales, para determinar la diversidad microbiana total aislada. Se espera que los resultados que se obtengan en esta investigación, provean información en cuanto a la química y fisiología de las poblaciones microbianas que interactúan con la planta; y que además provee nuevos organismos con potencial biotecnológico.
Técnicas y Progreso
Son muchas las técnicas aprendidas a lo largo de esta investigacion, pero entre ellas puede mencionarse el PCR; tanto del 16sRNA, como el PCR a partir del TRFLP. Esta técnica es utilizada para determinar la presencia de bacterias en las muestras obtenidas. El PCR se lleva a cabo luego de haber realizado la extracción de DNA de la muestra que se desea amplificar. Hasta el momento, se han realizado PCR de 16sRNA de dos plantas diferentes a dos diversas profundidades, de ambas localizaciones (Boquerón y las Salinas de Cabo Rojo); en ambos se han obtenido amplificaciones exitosas. En este momento, se está trabajando con el PCR del TRFLP, pero estos son un poco más trabajosos, y hay que realizarlos con más cuidado porque además de todo son sensitivos a la luz, por lo que hay que trabajar en oscuridad; lo cual dificulta un poco más el proceso.
Hasta este momento del semestre, puedo clasificar el progreso de la investigación con relación a las metas establecidas, como un 2; ya que aunque se ha cumplido más del 10% de los objetivos, todavía no es suficiente como para tener el 50%. Con la purificación de las cepas aisladas vamos en buen progreso, la mayoría de las cepas ya se encuentran en un estado avanzado de purificación. Como se mencionó previamente, se está trabajando con PCR16sRNA y de TRFLP; con el PCR 16sRNA estamos obteniendo resultados satisfactorios; y con el TRFLP continuamos trabajando. En cuanto a las genotecas ambientales mencionadas en los objetivos propuestos, se puede decir, que se encuentra en una etapa en progreso. Esperamos que a medida que vaya pasando el semestre y continuemos trabajando en el laboratorio, podamos cumplir todas las metas y objetivos propuestos, de una manera satisfactoria.
Metas propuestas para este semestre…
Este verano tuve la oportunidad de participar de un internado como parte de HACU (Hispanic Association of Colleges and Universities), el cual es un programa que le brinda la oportunidad a los estudiantes, de trabajar en diversas agencia federales, de acuerdo a su área de estudio. En mi caso, tuve la oportunidad de trabajar para el Food and Drug Administration, mejor conocido como el FDA, esto en College Park, Maryland. Me encontraba trabajando en el Departamento de Microbiología, bajo la supervisión de la Dra. Valerie Tournas. Mi trabajo titulado “Determination of Fungal Levels in Foods Using the FDA Official Method and the SimPlate Yeast and Mold Color Indicator”, estaba basado en el cultivo y análisis de diferentes muestras de alimentos, con el propósito de determinar si había o no presencia de levaduras y/o mohos en ellos. Para esto, se utilizaron diferentes medios de cultivo como por ejemplo: utilizamos Potato Dextrose Agar, Dichloran Rose Bengal Agar, Potato Dextrose Agar with Chloramphenicol, Tryptic Soy Agar, Dichloran Glycerol Agar, entre otros tantos. Trabajando en el FDA pude practicar técnicas que ya conocía, así como también pude aprender nuevas técnicas y procedimientos. Entre esto se puede mencionar, la técnica de estriado en plato, la transferencia de cultivos para mohos, levaduras y bacterias, la técnica de “Simplate”, realizar “Petrifilms”, técnicas de filtración, entre otras. Este internado fue una experiencia en la cual aprendí, apliqué mi conocimiento en mi área de estudio, adquirí nuevos conocimientos y además tenía toda mi concentración en eso, ya que yo era la única estudiante trabajando para la Dra. Tournas, por lo que todo el trabajo y responsabilidad recaía en mi persona.
Para este semestre, se han planteado nuevas metas entre las cuales podemos mencionar:
1. Purificación de sepas, aisladas previamente el semestre anterior.
2. Análisis de diversidad, por medio de la realización de TRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) de comunidades bacterianas en dos distintos lugares de muestreo, y a diferentes profundidades.
3. Además, se realizarán genotecas ambientales, con el fin de determinar la diversidad microbiana total aislada; esto como una técnica independiente de cultivo.
Con relación al semestre anterior, el cual se enfocó en técnicas dependientes de cultivo, tales como preparación de medio, tinciones, purificaciones y criopreservación; este semestre se trabajara más con el área independiente de cultivo. Con esto, nos referimos a la realización de DNA total, PCR 16 S, TRFLP y genotecas ambientales. Además de esto, se planea desarrollar un protocolo el cual estará adaptado para la técnica de DAPI en el suelo.
Experiencias en el primer semestre de investigación:
Aquí se presentan algunas de las experiencias de este semestre, para mi proyecto de investigación. Durante este tiempo que he tenido para trabajar en mi investigación, han sido muchas las cosas que he aprendido; y estos conocimientos no solo se limitan al experimento en sí. Entre otras cosas, he aprendido a sobrellevar más cargas y tareas, a tener más responsabilidades y cómo organizarme para poder llevar a cabo todos los objetivos propuestos. En cuanto al proyecto como tal, he aprendido técnicas que aunque había escuchado y tenía un poco de conocimiento teórico, en la práctica no lo había implementado hasta este momento. Por ejemplo, realizar extracciones de DNA genómico total de muestras de suelo del Mangle Negro en las Salinas de Cabo Rojo. Aunque ya había realizado extracciones de DNA, lo había realizado a muestras en específico, pero no una extracción total, y aquí tuve la oportunidad de realizarlo. Por otra parte, hasta este momento continuamos con la purificación de muestras; cultivamos las muestras en platos Petri, les realizamos tinción Gram para determinar que contiene el plato, y saber así si la muestra está pura o si hay que purificarla nuevamente.
El proceso de purificación de las muestras ha tomado más tiempo del esperado, debido a que son demasiadas las muestras a purificar y que además, en la mayoría de los platos tenemos más de un organismo; por lo que hay que continuar purificando. Esto era algo que no esperábamos que tomara tanto tiempo, pero debido a esto, al momento en que nos toca realizar los muestreos mensuales en las Salinas, todavía no hemos terminado de purificar las muestras anteriores. Aunque a pesar de que la purificación nos ha dado un poco de trabajo, esto no ha sido razón para detener la investigación, o para decir que no estamos obteniendo resultados satisfactorios. Por el contrario, continuamos purificando muestras, analizando y observando una gran diversidad de microorganismos en el mangle negro de las salinas, y esto es realizado a diferentes concentraciones de sal, a tres diferentes profundidades.
Para el nuevo semestre que está próximo a comenzar, esperamos continuar trabajando de una manera eficiente y responsable, para cumplir a cabalidad con las expectativas propuestas en esta investigación. Lo que se quiere, es continuar con la purificación de muestras, para realizar extracción de DNA a cada una de ellas y secuenciarlas, de manera que podamos obtener una lista de los microorganismos que se encuentran en estos mangles. Además, la idea fundamental es el determinar y estudiar la diversidad microbiana que aquí existe, y comparar si las diferentes profundidades y concentraciones de sal, son un factor importante en la diversidad; y si debido a esto, la diversidad es más variada o si los microorganismos son los mismos. Para poder lograr todo esto, hay que continuar buscando información, y trabajando en equipo como hasta el momento; porque si no fuese de esta manera, el trabajo no podría realizarse de igual manera; sería muchísimo más complicado. Espero con el tiempo, poder seguir adquiriendo nuevas experiencias y aprendiendo técnicas y procedimientos nuevos; así como microorganismos de los cuales desconozco y que se desconoce de su existencia y función para el medioambiente asi como para la ciencia en general.
Mi investigación, ¿en qué se basa?
Mi trabajo de investigación consta en el estudio de la diversidad microbiana halofílica de las rizosferas del mangle negro. El estudio de los mangles negros es único de nuestro laboratorio de investigación, ya que es algo que no había sido estudiado previamente. Este es basado en los hallazgos de una estudiante de este laboratorio, quien encontró que en hojas de las rizosferas de estos mangles, había una gran diversidad bacteriana halofílica. Y ahora es nuestro trabajo y nuestro objetivo, el estudiar esta diversidad, cosa que sería de gran importancia para el campo de la investigación.
Mi mentor lo es el Dr. Rafael Montalvo. Seleccioné el campo de la microbiología como mi área de investigación, primero que nada porque en este momento, este es mi campo de estudio; y es uno que me llena de gran interés y satisfacción al ponerlo en práctica. Pienso que esta es un área en la cual todo el trabajo que uno realice tiene sentido, aunque a veces los resultados obtenidos no sean los que comprueban tu hipótesis o sencillamente no eran los esperados; a pesar de eso, lo encontrado funciona y tiene algún valor dentro del campo de la ciencia y la investigación. Es por eso que todo trabajo en el campo de la investigación es tan importante y relevante.
Hasta el momento la experiencia de laboratorio me ha gustado mucho; en lo personal ha sido bastante satisfactoria y gratificante. He aprendido nuevas cosas, he tenido la oportunidad de poner en práctica conceptos ya aprendidos en otras clases. Y definitivamente, he aprendido nuevas técnicas de laboratorio, que van desde como preparar las muestras luego de hacer los muestreos, y todo el proceso de purificación de estas, hasta realizar técnicas moleculares. En el laboratorio, participo de reuniones con mi mentor y con la estudiante graduada con la cual trabajo.
Las metas que nos hemos propuesto mi mentor y yo para el final de este semestre, es lograr tener todas las muestras debidamente purificadas, para comenzar entonces con los procesos de secuenciación e identificación de la diversidad bacteriana en las rizosferas de estos mangles.
Bienvenidos a mi BioBlog!
Bienvenidos sean todos a este nuevo BioBlog, el cual va a estar basado en mi trabajo de investigación. Esta se enfoca en el estudio de la diversidad microbiana halofílica que se encuentra en las rizosferas del mangle negro. Espero que este nuevo espacio sea del agrado de todos…
Gracias,
Juliany
